nódulos

Asimilación del nitrógeno (tema 18)

Al igual que ocurre con el carbono, el nitrógeno debe ser reducido. En la naturaleza el carbono, el nitrógeno y el azufre se encuentran mayoritariamente oxidados, pero en los seres vivos, están reducidos. Las rutas de estos 3 elementos están relacionadas: a los cetoácidos del carbono se les añade nitrógeno para obtener aminoácidos a los que también se les puede añadir azufre. El metabolismo del azufre depende del metabolismo de nitrógeno y este, a su vez, del carbono.

La importancia del nitrógeno es cuantitativa: es el más abundante después del carbono, hidrógeno y oxígeno; pero además es cualitativa ya que forma parte de aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, pigmentos fotosintéticos y moléculas defensivas como alcaloides y glucósidos cianogénicos entre otros.

Su deficiencia produce una serie de síntomas de entre los cuales el más llamativo es la reducción de tamaño y seguido por la clorosis (disminución en la cantidad de clorofilas) de las hojas viejas (es un elemento móvil). Su falta  también puede producir un exceso de carbono, lo que puede ser utilizado para la fabricación de antocianinas dándole a la planta un color morado característico.

Los 3 principales reservorios de nitrógeno en la naturaleza son:

Atmósfera > seres vivos > suelo

El nitrógeno atmosférico N2 no está disponible de manera general para los organismos. Cuando este nitrógeno atmosférico pasa al suelo se dice que se ha fijado; es un proceso realizado en exclusiva por los microorganismos ya sean de vida libre o simbióticos, pero esto sólo  representa el 20% del nitrógeno asimilado en la biosfera, el 80% restante proviene de la asimilación de nitrato y amonio. Además de la fijación biológica hay una fijación industrial (fertilizantes industriales) cuyo abuso conduce a una contaminación de los acuíferos. Otro mecanismo de fijación de nitrógeno abiótico es la electricidad atmosférica (aunque es muy pequeña).

El NO2 no es tóxico, pero el nitrito si lo es; en niños pequeños constituye un problema porque la hemoglobina fetal es muy susceptible de unirse a nitrito haciéndola  disfuncional.

En los seres vivos el nitrógeno está en forma orgánica y las plantas, no pueden asimilarlo (no asimilan ningún elemento en forma orgánica, por ello antes debe producirse una mineralización de la que se obtiene NH4 (este proceso también se denomina amonificación). En el suelo no se observa gran cantidad de NH4 sino de NO3; esto se debe a que las bacterias nitrificantes oxidan el NH4+ a nitrito y éste a nitrato por el proceso de nitrificación, por lo que el nitrógeno estará disponible para las plantas mayoritariamente en forma de nitrato.

El nitrógeno volverá a la atmósfera por la desnitrificación, proceso realizado por bacterias anaerobias que forman gases de nitrógeno que van a parar a la atmósfera.

Asimilación del nitrato.

Consta de 4 fases: Entrada de nitrato, reducción de nitrato a nitrito, reducción de nitrito a amonio y por último, asimilación del amonio.

La absorción del nitrato se realiza por una proteína transportadora: el transportador de nitrato, el cual hace un simporte (transporte activo secundario) de nitrato y protones al interior celular, por lo que depende de la ATPasa de H+ del plasmalema. El transportador de nitrato está regulado por el propio nitrato así como por productos derivados de la asimilación de nitrato. Se sabe que hay al menos 2 familias de transportadores. La familia NTR2 presenta una cinética de saturación mientras que la familia NTR1 no se satura y funciona a concentraciones de NO3 más altas que NTR2.  El clorato también entra en la célula por estos transportadores NTR.

Una vez el nitrato ha entrado en la célula, es en el citosol donde ocurre la siguiente fase: la reducción del nitrato a nitrito por acción de la enzima nitrato reductasa. Los 2 electrones se toman del NADH o del NADPH. La enzima está formada por dos monómeros con 3 dominios cada uno a los que se asocian diversos cofactores y grupos prostéticos: FAD, grupos hemos y un átomo de Molibdeno unido a pterina: cofactor de Mo o también llamado MoCo y aunque el nombre puede inducir a error, no tiene cobalto.

Ya en el cloroplasto, el nitrito es reducido a amonio por la nitrito reductasa y conlleva la utilización de 6 electrones que se toman del sistema ferredoxina de la cadena de transporte de electrones fotosintética; si no funciona el aparato fotosintético, la ferredoxina es reducida y regenerada por el NADPH. La nitrito reductasa cuenta con un único monómero que tiene dos dominios: uno ferredoxina y grupo sulfoférrico y otro sirohemo (un grupo hemo especial).

Regulación.

La regulación del ciclo ocurre a dos niveles; uno a nivel de expresión de las enzimas nitrato y nitrito reductasa, y otro, a nivel de su actividad. Todos los genes que regulan la síntesis peptídica son nucleares.

En la expresión  de los genes el principal factor regulador es el nitrato; sin nitrato las enzimas nitrato y nitrito reductasa van a estar en concentraciones muy bajas, otros factores reguladores son por ejemplo la luz, que aumenta los niveles de azúcares, y los propios azúcares. Durante la transición de planta etiolada a planta verde van a estar implicados los citocromos. Hasta ahora, los factores de los que se ha hablado son reguladores positivos; un regulador negativo o represor es la glutamina, que además es un producto de la asimilación de nitrato.

La nitrito reductasa está activa durante las horas de luz, su activación implica una fosforilación y la unión a una proteína reguladora. En las horas de oscuridad, la nitrito reductasa está inactiva; se produce un cambio de su conformación que expone una serie de residuos que la hacen sensible a la degradación por proteasas. Por la noche se detiene la formación de amonio ya que si no se desactiva la nitrato reductasa se acumularía nitrito que es tóxico para la planta (mucho más que el amonio) y la planta tiene mucha cantidad de esta enzima. La actividad de la nitrato reductasa depende, además de la luz y de la oscuridad, de su fosforilación y la interacción con una proteína reguladora. Por lo que puede considerarse un proceso reversible.

Metabolismo del Carbono y del Nitrógeno.

En el metabolismo del carbono se obtienen los cetoácidos a los que se unirá la glutamina obtenida del ciclo del nitrógeno dando lugar a los distintos aminoácidos. Los carbohidratos regulan positivamente los genes de las nitrito y nitrato reductasa mientras que la glutamina, lo hace negativamente. Esto establece una relación de coordinación entre los dos ciclos: si el ciclo del carbono va más rápido que el nitrógeno, aumenta la velocidad de este. Pero si el carbono va más lento, ralentiza al nitrógeno.

Regulación por nitrato del metabolismo del Nitrógeno y del Carbono.

El nitrato es la principal fuente de nitrógeno para las plantas y regula muchos genes del metabolismo del carbono. Las enzimas de color verde en la siguiente imagen están reguladas positivamente (degradación de carbohidratos) por la presencia de nitrato, mientras que las de color rojo negativamente (síntesis de carbohidratos).

Asimilación de nitrato en la planta.

En el suelo hay amonio pero sobretodo nitrato. El amonio es asimilado directamente en la raíz, pero el nitrato puede tener dos destinos. En uno el nitrato es transformado a amonio y asimilado en la raíz, en otro, puede transportarse por el xilema y acumularse en vacuolas o bien, en otros órganos. En las plantas que están formando semillas se va a producir una degradación de proteínas que va dar lugar a un suministro de nitrógeno que será transportado a los sumideros.

Asimilación del Amonio.

La asimilación del amonio se realiza principalmente por la vía GS·GOGAT pero a su vez, el amonio puede venir de dos vías de asimilación primarias (fijación biológica una y asimilación del nitrato otra) o bien, de vías de reciclaje (degradación de proteínas por ejemplo) y de la fotorrespiración. En cualquier caso, la única vía de asimilación es la GS·GOGAT. Los mutantes de esta vía son TODOS inviables.

El GS·GOGAT transfiere el nitrógeno a un cetoácido para formar un aminoácido. La glutamina sintetasa (GS) consume ATP y transfiere el grupo amido. La glutamato sintasa (GOGAT) usa poder reductor que obtiene de la ferredoxina o del NADH.

La glutamina sintetasa es una enzima compleja: está formada por 8 polipéptidos que permiten diferenciar hasta 8 isoenzimas. En los cloroplastos de las hojas se encuentra la isoenzima GS2 que consta exclusivamente de subunidades γ y está relacionada con la fotorrespiración. En el citosol de las células de las hojas se encuentra la Gs1, que es una mezcla de subunidades α y β y es protagonista de los procesos de degradación, reciclaje y transporte. En las células de las raíces la GSr, muy parecida a la citosólica ya que las dos guardan relación con los procesos de senescencia. La GSn es fundamental en la nodulación y cuenta con polipéptidos β y γ.

La regulación de la GS se produce a nivel de expresión génica: la síntesis de los polipéptidos γ es regulada por nodulación, nitrato y amonio, mientras que los α y β, por senescencia.

GOGAT es más sencilla: consta de un solo polipéptido y puede presentar 2 isoformas; una que está presente en cloroplastos y otra que lo está en los plastos no fotosintéticos como por ejemplo, los de raíces y simbiontes de rizobios. En la isoforma cloroplástica la fuente de electrones es la ferredoxina y participa en el reciclado del NH4 de la fotorrespiración y la asimilación. La isoforma de los plastos no fotosintéticos utiliza como fuente de electrones el NADH y participa en procesos de asimilación y simbiosis.

Otras enzimas del metabolismo del Amonio.

En plantas hay una enzima que incorpora directamente el amonio al oxoglutarato: la glutamato deshidrogenasa, no es la principal enzima que lleva a cabo esta función ya que eso corresponde a la GS·GOGAT, pero tampoco es esa su principal función, ya que la glutamato deshidrogenasa actúa principalmente en el catabolismo de aminoácidos y cuando el NH4 está a concentraciones muy altas, puede tener función detoxificadora.

Otra familia de enzimas muy importantes en el metabolismo del nitrógeno son las aminotransferasas, que antiguamente se llamaban transaminasas). Estas enzimas transfieren el grupo amino de un aminoácido a un cetoácido, en este caso, la GS·GOGAT sirve de donador de nitrógeno reducido.

Asimilación de Nitrógeno inorgánico en aminoácidos.

Son 4 los aminoácido implicados: glutamina, glutamato, aspartato y asparagina. Todos sirven para el transporte de nitrógeno, los 3 primeros para la síntesis de otros aminoácidos y el último, para el almacenamiento debido a su estabilidad y a la cantidad de nitrógeno que tiene con relación a la de carbono.

La asparagina sintetasa consume ATP y consigue  Asn y glutamato a partir de glutamina y aspartato (el grupo amido se cede al aspartato). En bacterias esta enzima une amonio al aspartato y forma asparagina; se piensa que en condiciones en las que las concentraciones de amonio son altas, las plantas pueden hacer lo mismo.

Transporte de Gln Vs. Asn.

Las plantas usan Glicina o asparagina. Cuando el carbono no es limitante, sintetizan y transportan glicina, pero en oscuridad, al detenerse la fotosíntesis y disminuir la cantidad de carbono, se usa asparagina porque utiliza menos carbono que la glicina.

Fijación biológica del Nitrógeno.

La fijación biológica del nitrógeno es una capacidad exclusiva de microorganismos, de entre los cuales, algunos la realizan en vida libre y otros en simbiosis con las plantas.

De entre los simbióticos los más importantes son los rizobios, aunque no son los únicos. Las actinorrizas hacen simbiosis con el género Franckia (actinomicetos), otros ejemplos son Anabaena (cianobacteria) y Azolla (helecho acuático), este último, de vital importancia para los cultivos del arroz.

En todos los microorganismos la nitrogenasa se inactiva por oxígeno, por lo que tiene que desarrollar una serie de mecanismos para conseguir aislarla de él. Las cianobacterias por ejemplo lo consiguen con el desarrollo de los heterocistos: células especializadas que cuentan con una pared que impide el paso de oxígeno; los heterocistos ni tiene PSII para no producir oxígeno, pero las bacterias anexas sí.

En plantas la fijación de nitrógeno ocurre en los nódulos, los cuales van a contar con una pared “aislante” y un transportador y sistema de transporte especializados. La pared del nódulo no es totalmente impermeable al oxígeno para que la célula pueda darle al rizobio carbohidratos y del mismo modo, él pueda pasar a la célula el nitrógeno, esto es debido a que el rizobio necesita carbohidratos para poder fijar  nitrógeno.

Una molécula clave en el proceso de fijación es la leghemoglobina: una proteína con un grupo hemo (le da a los nódulos un color rosado) y sirve para lo mismo que la hemoglobina de la sangre: transportar oxígeno. Esto es importante que quede claro, ya que la leghemoglobina no se encarga de retirar el oxígeno básicamente porque nitrogenasa y leghemoglobina están en compartimentos distintos; la leghemoglobina transporta exclusivamente el oxígeno al bacteroide.

Dentro del nódulo hay proteínas llamadas nodulinas que pueden ser específicas del nódulo y cuya síntesis es estimulada por la simbiosis.

La simbiosis no es obligatoria y sólo se establece cuando la planta necesita nitrógeno. La planta emite compuestos quimioatrayentes de rizobios (principalmente flavonoides) que inducen, además, la expresión de genes cuyas proteínas sintetizarán los factores nod que activarán en la raíz el proceso de nodulación.

Los factores nod son cadenas integradas por unidades de N-acetil-o-glucosamina en cuyo extremo hay un ácido graso. A este esqueleto se le incorporan  diversas modificaciones que darán lugar a la molécula final. Los factores nod interaccionan con las lectinas (responsables de la interacción con proteínas radicales de las plantas).

Proceso de nodulación.

En primer lugar el rizobio se aproxima y une al pelo radical en respuesta a la secreción de atrayentes químico secretados por las raíces de la planta. A su vez, las bacterias emiten una sería de factores que provoca un crecimiento anormal del pelo radical, este crecimiento es curvilíneo y diferencia una zona protegida en el pelo radical. Los rizobios se establecen bajo el amparo de la zona de enrrollamiento y es en esa zona donde se degradará la pared celular del pelo radical facilitando la infección. Se forma entonces el tubo de infección a partir de vesículas del aparato de Golgi de la célula radical, el tubo alcanza el otro extremo de la célula y se fusionan las membranas de la célula del pelo radical. Los rizobios son liberados en el apoplasto y penetran por la lámina media a la membrana plasmática de la célula subepidérmica, se forma un nuevo tubo de infección que se expande y ramifica hasta que llega a las células diana, donde las vesículas que contienen las células bacterianas se rompen liberando las bacterias al citosol.

Fijación simbiótica.

La nitrogenasa es un complejo formado por dos proteínas, la primera subunidad es la ferroproteína, la cual consta de dos monómeros iguales que contienen hierro; la otra subunidad es la dinitrogenasa, formada por 4 subunidades de dos tipos que tienen átomos de Mo y Fe.

La reacción catalizada es la reducción del N2 a NH4 y supone un intercambio de 6 electrones bajo consumo de 8 por que también se obtiene hidrógeno. Los electrones vienen de la ferredoxina y se necesita un montante de 16 ATP, lo que hace la reacción muy costosa desde el punto de vista energético.

Control de la concentración de Oxígeno en el Nódulo.

La estructura responsable de dicho control es el cortex interno, el cual limita la entrada de oxígeno que pasa al interior. La resistencia que ofrece es variable en función de las necesidades de oxígeno en el interior. Aún no está muy claro cómo ocurre, pero se piensa que se produce alterando el contenido hídrico en la célula: al aumentar el contenido hídrico, aumenta la resistencia al paso.

El poco oxígeno que entra no es capaz de inactivar a la nitrogenesa. La leghemoglobina se encuentra en la célula vegetal y transporta el oxígeno al bacteroide. A él también llegan sacarosa y malato por acción de una isoenzima de la PEPC. El malato es respirado en el bacteroide para obtener amonio.

El oxígeno transportado al bacteroide por la leghemoglobina es captado por los transportadores de electrones. La función de la leghemoglobina no es proteger a la nitrogenasa del oxígeno directamente ya que transporta suficiente oxígeno como para que la bacteria respire.

El amonio que se obtiene no es transportado ya que lo que se envía fuera de la célula es el nitrógeno asimilado.

Se diferencian 2 tipos de nódulos atendiendo al producto que exportan: unos exportan amidas, son los nódulos indeterminados y conservan actividad meristemática. El otro tipo de nódulos incluye a todos aquellos que transportan uréidos (alantoína y ac. alantoico mayoritariamente) y se denominan determinados. Estos últimos son esféricos porque todas sus células se diferencian a la vez.

Los nódulos determinados transportan más nitrógeno que los indeterminados, lo que lleva a plantearse por qué entonces no transportan todos uréidos; la respuesta es muy sencilla y guarda relación con el tipo de nódulo; los esféricos (determinados) tienen elementos conductores con menos recodos, más rectos, mientras que los indeterminados tienen elementos conductores más finos e intrincados. Si tenemos en cuenta esto y sabemos que los uréidos son hidrosolubles, si se transportasen en los nódulos indeterminados destruirían los tubos de conducción.

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