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El ciclo de Calvin

El ciclo de Calvin se puede encontrar en la bibliografía como fase oscura de la fotosíntesis, pero esto no es del todo correcto ya que precisamente el ciclo de Calvin no funciona en oscuridad. El hecho por el que se conoce por ese nombre es porque se observó que cuando se retiraba la luz, las reacciones del carbono seguían ocurriendo durante algunos segundos después. Esto se debe a que las enzimas implicadas tardaban unos segundos en inactivarse.

La fotosíntesis es el proceso por el cual los organismos autótrofos asimilan carbono. Se utiliza la energía de la luz para obtener ATP y NADPH y de ese modo reducir CO2 y sintetizar carbohidratos. Ocurre en dos fases: en la primera la energía lumínica se transforma en química y en la segunda fase, el NADPH y el ATP producidos en la primera se utilizan para obtener los carbohidratos consumiendo CO2 y O2. Mientras que las reacciones lumínicas ocurren en el tilacoides, las reacciones del carbono ocurren en la fase acuosa, el estroma.

El ciclo de Calvin es la única vía de asimilación de carbono (reducción e incorporación a materia orgánica) de todos los organismos eucariotas fotosintéticos. Sólo algunos procariotas utilizan vías alternativas. Se conoce por otros nombres como vía C3 (debido a que el primer compuesto estable es una molécula con 3 átomos de carbono: 3-fosfoglicerato), ciclo reductivo de las pentosas fosfato (refiriéndose a la vía de las pentosas fosfato que ocurre en el cloroplasto) o bien, ciclo de reducción fotosintética del carbono.

Se trató de encontrar un compuesto de 2 átomos de carbono al que se le uniera el CO2, pero no se encontró. En estudios posteriores se observó que la concentración de PGA era el doble que la de un azúcar de cinco carbonos: la ribulosa  bisfosfato (RuBP). Cuando se quita la luz, la RuBP desaparece progresivamente mientras que aumenta el PGA; lo que sugiere que la RuBP es el precursor del PGA. Cuando se vuelve a encender la luz, vuelven a aumentar los niveles de RuBP a expensas del PGA, llevando a la conclusión de que el PGA, a su vez es el precursor de la RuBP.

1. Fases del ciclo de Calvin.

Desde el punto de vista bioquímico, el ciclo de Calvin está dividido en 3 etapas: carboxilación, reducción y regeneración.

En la carboxilación el CO2 se une a un compuesto de 5 carbonos para formar 2 moléculas de 3 carbonos. En esta fase por tanto, se reduce el CO2. En la siguiente fase, la reducción, se consumen NADPH y ATP y se reduce el PGA (la molécula de 3 carbonos obtenida en la etapa anterior) generando una triosa, triosa que en la última etapa, la fase de regeneración (que es la más larga del ciclo) formará la RuBP con el gasto concomitante de una molécula de ATP.

Como puede deducirse, el ATP y el NADPH obtenidos en la fotosíntesis se utilizan en la fase de reducción del ciclo de Calvin (donde se produce el mayor gasto energético del ciclo) y en la fase de regeneración.

La estrella del ciclo de Calvin es la rubisco (ribulosa bisfosfato carboxilasa oxigenasa). Es una de las enzimas más abundantes; en las hojas puede representar hasta el 50% de las proteínas. Está constituida por 8 subunidades grandes (L) y 8 subunidades pequeñas (S): L8S8. En algunas bacterias la rubisco está constituida por 2 subunidades grandes L2.

En las plantas, cada tipo de subunidad se sintetiza en distinto sitio, de manera tal que la pequeña la codifica el genoma nuclear y se sintetiza en el citosol y la grande está codificada por el genoma del cloroplasto y es en él donde se sintetiza y ensamblan las distintas partes por mediación de las chaperonas.

La rubisco cataliza dos tipos de reacciones; una es la reacción de carboxilación (si se une a CO2) y la otra reacción es la de oxigenación (si se une el O2). Es una enzima muy ineficiente; gran parte de esta ineficiencia se debe a que cuando realiza la oxigenación produce fosfoglicolato, un compuesto de dos carbonos inútil para la fotosíntesis y que por tanto implica la pérdida de esos dos átomos. Por suerte, la rubisco tiene más afinidad por el CO2 que por el O2: a 22ºC la rubisco carboxila 3 veces por cada reacción de oxigenación. Además de esta cinética, las plantas han desarrollado un ciclo bastante complejo para recuperar parte del carbono.

1.1 Primera Fase del ciclo de Calvin: Carboxilación.

La enzima que une el CO2 a la RuBP es la rubisco, esta adición del CO2 produce un intermediario de 6 carbonos inestable que se rompe dando lugar a dos moléculas de PGA. Al utilizar un método de marcaje radiactivo se observa la radioactividad en una de las moléculas de PGA.

El incremento de energía libre en esta reacción es elevado en valor absoluto y de signo negativo, lo que quiere decir que está favorecida termodinámicamente y no requiere por tanto ni de ATP ni de NADPH. La afinidad de la rubisco por el CO2 es mucho mayor que la afinidad que tiene por el oxígeno.

1.2 Segunda Fase del ciclo de Calvin: Reducción.

Esta etapa consta de dos pasos. En el primero una quinasa (enzima que fosforila) convierte el fosfoglicerato en bisfosfoglicerato consumiendo una molécula de ATP. En el segundo paso, la gliceraldehido-3-P deshidrogenasa reduce al bisfosfoglicerato obteniendo gliceraldehido-3-fosfato (GAP) y consumiendo NADPH. Esta fase es la más costosa del ciclo energéticamente hablando y constituye en sí misma un punto de control ya que la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa tiene función reguladora. Esta enzima tiene una isozima en la glucólisis, la diferencia entre ella es que mientras que la del cloroplasto utiliza NADPH, la del citosol utiliza NADH.

Por cada CO2 que se introduce, se obtiene una molécula de GAP que se utiliza para regenerar la RuBP en la tercera fase del ciclo.

1.3 Tercera Fase del ciclo de Calvin: Regeneración.

Esta última etapa es la más larga; de las 13 enzimas que participan en el ciclo, 2 son exclusivas de esta etapa y del ciclo (evidentemente, excluyendo a la rubisco que es otra enzima exclusiva de Calvin pero que no actúa en la regeneración sino en la carboxilación). Estas dos enzimas son:

  • Sedoheptulosa 1,7-bisfosfatasa
  • Fosforibuloquinasa

Esta última etapa consiste en una regeneración de las moléculas en la que a partir de triosas se obtienen pentosas. Por cada 5 triosas se obtienen 3 pentosas gastando 3 ATP. Además de estas enzimas exclusivas, en esta etapa también se encuentra la fructosa 1,6-bisfosfatasa que constituye un punto de regulación del ciclo, participa en la síntesis de almidón y que cuenta con una isozima citosólica que participa en la síntesis de sacarosa.

La sedoheptulosa 1,7-bisfosfato es una fosfatasa y la fosforibunoquinasa cataliza la útima reacción del ciclo; también puede llamarse ribulosa 5-fosfatoquinasa.

2 Haciendo cuentas.

Por cada CO2 que se fija, se obtienen: 2PGA en la primera etapa y 2GAP en la segunda etapa de los cuales 1 se invertirá para formar un azúcar y el otro para la regeneración de la RuBP.

Si la RuBP tiene 5 carbonos y de la segunda etapa nos llegan siempre de tres en tres, necesitaremos 5 GAP para alcanzar la cifra redonda de regeneración de 3 RuBP; Los GAP por otro lado se obtienen de dos en dos, esto quiere decir que por cada 6 GAP, 5 se invierten en la regeneración de la RuBP (5C) y 1 en la formación de una hexosa, pero para formar una se necesitan 6 carbonos y sólo tenemos 3, por lo que necesitamos otro ciclo completo para liberar otro GAP e invertirlo en la formación de una hexosa. Si para producir una hexosa se han necesitado 2 GAP de un total de 12 (6+6), los 10 restantes se han invertido en la regeneración de RuBP; si los GAP tienen 3 carbonos y las RuBP 5, por cada 10 GAP se regeneran 6 RuBP, que es la cantidad inicial que necesitamos para cerrar e iniciar de nuevo el ciclo y conseguir una hexosa. Esto quiere decir que se necesitan 6 moléculas de CO2, 18 ATP y 12 NADPH.

 3 Características del ciclo.

El ciclo de Calvin cuenta como se ha visto hace un momento con tres enzimas exclusivas. La Rubisco participa en la primera etapa y genera 2 moléculas de PGA por cada RuBP que une a CO2. La seduheptulosa-1, 7-bisfosfatasa actúa en la tercera etapa del ciclo y genera seduheptulosa-fosfato y fosfato inorgánico por cada seduheptulosa bisfosfato que utiliza. Y por último ribulosafosfatoquinasa, que también actúa en la última etapa del ciclo genera RuBP y ADP a partir  de RuP y ATP.

En términos de rendimiento se puede decir que el ciclo de Calvin es bastante eficiente en comparación con otros eventos metabólicos ya que tiene un rendimiento del 90%; La producción de una hexosa consecuencia de la hidrólisis de 18 ATP y 12 NADPH conlleva el gasto de 3180KJ/mol y con la oxidación de esa hexosa se recuperan 2880 KJ/mol. Evidentemente, este rendimiento del 90% es puramente teórico ya que la función de oxigenación de la rubisco disminuye en gran medida este valor.

Otra característica importante del ciclo es la autocatálisis, esto quiere decir que es capaz de autoreacelerarse porque puede regenerar más aceptor (RuBP) del que consume invirtiendo todo el GAP en la producción de RuBP a expensas de la producción de hexosas. Hasta la fecha, es la única vía de asimilación de carbono con capacidad catalítica.

4 Regulación.

La regulación intenta asegurar unos niveles adecuados de intermediarios y evitar que se produzcan ciclos fútiles; si durante el día se llevara a cabo la síntesis y degradación de carbohidratos no se llegaría a ningún lado, por eso ambos procesos están separados temporalmente.

A largo plazo el ciclo está regulado por la expresión de genes, como en la transición de planta etiolada a planta verde, mientras que a corto plazo la regulación queda impuesta por el control de la actividad de las enzimas como por ejemplo con el mecanismo ferredoxina/tiorredoxina llevando a cabo una modificación covalente de las enzimas en un grupo sulfidrilo, la carbamilación de la rubisco, cambios en el pH, la formación de complejos enzimáticos y el transporte de triosas del cloroplasto al citosol.

4.1 Regulación por el sistema Ferredoxina-Tiorredoxina.

El principal factor regulador del ciclo es la luz y el segundo más importante el sistema ferredoxina-tiorredoxina. Las tiorredoxinas son proteínas pequeñas con grupos sulfidrilos que pueden estar oxidados (formando un puente disulfuro) o reducido. Las ferredoxinas regulan la actividad de otras proteínas que tienen cisteína oxidándolas o reduciéndolas. Son proteínas  que pueden observarse en la gran mayoría de los compartimentos celulares conociéndose dos tipos: el tipo f y el tipo n. Cuatro encimas del ciclo de Calvin están reguladas por el sistema ferredoxina-tiorredoxina.

Las dos primeras: gliceraldehido-3-P deshidrogenasa y la fructosa-1, 6-bisfosfatasa son enzimas del cloroplasto de las que hay isozimas en el citosol, pero sólo las del orgánulo están reguladas por dicho sistema. Las dos últimas son exclusivas del ciclo de Calvin.

Cuando estas enzimas están reducidas son activas y la reducción se produce durante la luz. En oscuridad están oxidadas y no tiene actividad.

Los electrones del fotosistema  PSI  llegan a la ferredoxina, reduce a la tiorredoxina y a su vez la tiorredoxina reduce a la enzima objetivo; una de las cuatro enumeradas. Pero esto no siempre es así porque por ejemplo, la glucosa-6-P deshidrogenasa (la primera enzima de la vía oxidativa de las pentosas fosfato) está regulada de forma inversa, lo que quiere decir que cuando está oxidada la enzima está activa. Este hecho no es más que otra parte de mecanismo de regulación para evitar los ciclos fútiles. El nombre ferredoxina f proviene del descubrimiento de la regulación de esa enzima.

Otro mecanismo de regulación relacionado con éste es la formación de complejos supramoleculares, los cuales inactivan totalmente a grupos de enzimas. Su formación está relacionada directamente con la presencia o no de luz y se reconocen varios tipos. Uno de ellos implica a tres proteínas distintas: fosforibunoquinasa, CP 12 y gliceraldehido-3-P deshidrogenasa. Otro tipo de complejo implica exclusivamente a la gliceraldehido-3-P deshidrogenasa. El primer complejo se dice que es una regulación por CP 12 y el segundo, regulación por extensión C-Terminal.

Los iones también regulan el ciclo de Calvin en la transición oscuridad-luz. En luz se activa el transporte de electrones y aumenta la concentración de protones en  el lumen desde el estroma, esto lleva asociada la producción de ATP. Al aumentar en el lumen las cargas positivas se abren los canales de Magnesio al estroma, aumentando la cocentración de Mg en él y produciendo la consecuente subida del pH, factor al que es sensible la rubisco.

Además de estos factores, para que la rubisco funcione debe ser activada debidamente, para ello hay que realizar una modificación covalente que consiste en la unión de un CO2 y un átomo de Mg a una lisina del centro activo, a esta modificación se la denomina carbamilación. Como ya es costumbre en este ciclo, implica una regulación por luz y la liberación de protones.

Al estudiar in vitro la enzima en condiciones ideales para que ocurriera la carbamilación, la rubisco no se activaba, lo cual parecía indicar que había de por medio un factor desconocido que mediaba en la reacción. Fue al estudiar un mutante de Arabidopsis cuando se descubrió dicho factor desconocido que resultó ser una proteína a la que se denominó rubisco activasa. Se conocen dos proteínas con actividad rubisco activasa. Las dos proceden del mismo mRNA pero sufriendo distinto procesamiento teniendo al menos una de ellas un grupo sulfidrilo regulado por el sistema Ferredoxina-Tiorredoxina. La rubisco activasa hidroliza ATP y separa la RuBP de la rubisco, esto es de extrema importancia porque cuando finaliza el día, una molécula de RuBP queda  adherida el centro activo de la rubisco impidiendo la carbamilación y por tanto la activación de la rubisco. En esto caso, la RuBP actúa como inhibidor pero hay otro inhibidor muy parecido a la RuBP que como esta se une al centro activo de la rubisco, este inhibidor es el carboxiarabinitol-1-P.

Después de ver estos mecanismo es lógico pensar que la rubisco está regulada no directamente pero sí indirectamente por el sistema Ferredoxina-Tiorredoxina.

Últimamente se está relacionando el cambio climático con la actividad de la rubisco ya que una de las rubisco activasa tiene una mayor tolerancia a temperaturas elevadas lo que le confiere cierta ventaja sobre el otro tipo.

También puede concluirse que el CO2 es modulador (a la vez que sustrato de la actividad de la rubisco).

5 Transporte y regulación.

Las triosas fosfato se van a utilizar para la síntesis de almidón en el cloroplasto y sacarosa en el citosol mediante un translocador que introduce  fosfato inorgánico en el cloroplasto.

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